2020, Cilt 50, Sayı 1, Sayfa(lar) 027-034 |
[ İngilizce Özet ]
[ PDF ]
[ Benzer Makaleler ]
|
pADU94, Kloramfenikol Direncine Sahip Klonlama ve Ekspresyon Vektörü |
Hanife Salih, Erman Oryaşın, Bülent Bozdoğan |
Aydın Adnan Menderes Üniversitesi Rekombinant DNA ve Rekombinant Protein Uygulama ve Araştırma Merkezi (REDPROM), Aydın |
Anahtar Sözcükler: Klonlama vektörü, antibiyotik direnci, kloramfenikol, cat |
Amaç: Günümüzde genellikle ampisilin ve kanamisin direnç geni içeren vektörler klonlama amacıyla
yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmanın temel amacı, farklı bir direnç markırı, kloramfenikol direnç
geni taşıyan, beta-laktam direnç genlerinin de klonlanabileceği bir vektör oluşturmaktır.
Yöntem: Çalışmada, vektör omurgası için pUC19 ve transformasyon için Escherichia coli DH10B kullanılmıştır.
pUC19 plazmidi bla geni haricinde invers PCR yoluyla çoğaltılmış ve vektör omurgası olarak kullanılmıştır.
Bu omurgaya kloramfenikol direnç geni (cat) eklenmiştir. Oluşan pADU94 plazmidi E. coli
DH10B bakterisine aktarılmış ve transformantlar 10 ?g/ml kloramfenikol içeren besiyerinde seçilmiştir.
Konstrüksiyonu yapılan pADU94 vektörününe bla, gfp ve tsst klonlanmıştır. Klonlanan genlerin ekspresyonu
gfp için UV altında yeşil parlamanın varlığı ile test edilmiş ve bla için penisilin inaktivasyonu modifiye
Hodge testiyle gösterilmiştir.
Bulgular: Oluşturulan pADU94 vektörü E. coli DH10B bakterisine aktarılmış, plazmid varlığı ekstraksiyonla
doğrulanan transformantlarda kloramfenikol minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) değerinin
2 ?g/ml?den 64 ?g/ml?ye çıktığı saptanmıştır. pADU94 içerisine bla, gfp ve tsst genlerinin klonlandığı
M13 PCR ve plazmid ekstraksiyonuyla doğrulanmıştır. E. coli DH10B?ye bla geni aktarılması ile ampisilin
MİK düzeyi 8 ?g/ml?den ?128 ?g/ml?ye çıkmıştır. Ayrıca klonlanan beta-laktamaz geninin işlevselliği
modifiye Hodge testiyle doğrulanmıştır. pADU94 plazmidiyle mavi-beyaz seçilim yapılabileceği tsst
geninin klonlanmasıyla gösterilmiş ve beyaz kolonilerden plazmid ekstraksiyonu yapılarak tsst geninin
insert olarak varlığı doğrulanmıştır. Klonlanan gfp geninin eksprese olduğu ise UV altında yeşil parlama
görülmesiyle doğrulanmıştır.
Sonuç: Elde edilen sonuçlara göre, konstrükte edilen kloramfenikol direnç geni markırı içeren pADU94
vektörü, mavi-beyaz koloni seçimi ve gen ekspresyonu kapasitesine sahip bir vektördür. pADU94 vektörünün
gen ekspresyonunda ve DNA fragman klonlanmasında kullanılabileceği gösterilmiştir. Bu plazmidin
ayrıca bilinmeyen beta-laktam direnç genlerinin klonlanarak karakterize edilmesinde ya da bilinen
beta-laktam direnç genlerinin klonlama vasıtasıyla özelliklerinin araştırılmasında kullanılabilecek uygun
bir vektör olduğu belirlenmiştir. Bu çalışma ile farklı direnç markırlı vektörlerin laboratuvarda nasıl
oluşturulabileceği okurların bilgisine sunulmuştur.
|
[ İngilizce Özet ]
[ PDF ]
[ Benzer Makaleler ]
|